提取染色体dna的基本原理,操作中注意什么

2025-03-16 19:18:22
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回答1:

DNA与组蛋白构成核小体,核小体缠绕成中空的螺旋管状结构,即染色丝,染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中,外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞,然后破碎胞膜及核膜,使染色体释放出来,同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。
注意事项:
1.尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学物质对DNA的降解,为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。
2.防止基因组DNA的生物降解,主要是DNase降解基因组DNA,DNase需二价金属阳离子如Mg2+等的激活,可用EDTA等金属离子螯和剂螯和Mg2+以抑制DNase的活性。
3.减少物理因素对DNA的降解,物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、搅拌等),细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂,DNase大量释放,样品反复冻融和高温等。

回答2:

提染色体dna的基本原理:
基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大,以此增加外源基因获得率,但要获得大片段的DNA 非易事,细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA,而在抽提过程中,不可避免的机械剪切力必将切断DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要尽可能地温和操作,减少剪切力,减少切断DNA 分子的可能性;分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量,所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。
另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的,以满足基因工程中各种酶反应的需要,制备的样品必须没有蛋白污染,没有RNA,各种离子浓度应符合要求,这些在染色体制备时都应考虑到。
大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞,然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)破裂细胞,SDS 具有的主要功能是:(1)溶解细胞膜上的脂类和蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;(2)解聚细胞膜上的脂类和蛋白质,有助于消除染色体DNA上的蛋白质;(3)SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3 R2 —蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去,蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似,但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌,所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶,它能水解菌体细胞壁的主要学成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷键,有助于细胞壁破裂,破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌,同时用蛋白酶K 消化蛋白质,能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质,然后加入一定量的醋酸钾,使蛋白质变性,通常离心除去,在这期间可加入核糖酸酶消化RNA,最后用乙醇回收DNA。

提染色体dna的注意事项:
1、 重点防止DNA的损伤,包括各种物理、化学和机械损伤。
2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水,以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解,后面还需去离子。
3、 取上清时,如果上清液过少,可再加入少量水,重新离心,取上清,避免DNA损失过多。

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