请教:固体培养基是如何分离和计数微生物的？拜托了各位 谢谢

方法步骤： ①菌悬液的制备：如果用于分离的样品是水样液体则不需此过程，即可直接作为菌悬液。固体样品如土壤、泥等，则需制备菌悬液。具体做法是：称取样品1g，放入盛有99ml无菌水的三角瓶中，震荡5分钟充分摇均，使细菌分散。这样将样品稀释成为10-2菌悬液。 ②稀释：接10倍稀释法把制备好的10-2菌悬液稀释到10-8（液体样品稀释到10-6）。 取6支装有9ml无菌水的试管，编好号从10-3～10-8（液体样品从10-1～10-6）。用无菌移液管从10-2菌悬液中吸取1ml，放入编号10-3的试管中（无菌操作），用手轻压移液管上的橡皮头吸吹三次（吸入时一次比一次液面高），目的是将移液管中的菌悬液全部洗下并混匀，制成10-3菌液。用同一支移液管吸1ml10-3的菌液，放入编号10-4试管中混匀，重复以上操作制成10-4菌液。依此类推，直到第六管即编号10-8的试管，制成不同稀释度的菌液。 ③接种：难备好经灭菌的、温度为45～50℃的牛肉膏蛋白胨培养基140ml；经灭菌的培养皿（直径9cm）九套，分别标上10-6，10-7，10-8（每个稀释度三套），即做三个重复。 用经灭菌的移液管吸取1ml菌液，倒入相应编号的培养皿中，然后即可倒入培养基15ml（温度不能太高或太低，太高易把菌烫死，太低则易凝固）。倒入后立即轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液充分混匀，立即静止，水平放置待其冷却。凝固后即制成平板。注意在培养基冷却过程中不能摇动培养皿，否则培养基表面会凹凸不平。上述过程都进行无菌操作。 ④培养观察：将制作的平板放入30～37℃的恒温箱中培养1～2天。通过培养，即可见平板上长出各种不同的菌落。选择所需要的单个菌落，接种到斜面培养基上进一步培养后，进行镜检，如无杂菌，即成为纯种；如有杂菌，可再稀释分离，直到纯种。 稀释分离方法总结。 （2）平板画线法：分离纯化菌种最常用的方法。主要依据是，通过用接种环连续画线的移动过程中，使混杂的细菌分散开，经过培养，分散的单个细菌繁殖成单个菌落。 制作平板方法同稀释法，但是必须提前倒好，充分冷却后方可使用；并且表面必需光滑，厚薄均匀；培养基用量要比稀释法厚一些，每皿约20ml左右。接种使用接种环沾取待分离的混杂菌液（或固体培养基上的菌体少许），然后在平板表面一侧作第一次平行画线（无菌操作），画线占培养皿总面积的1/3即可。第一次画线完成后，左手把平板转动70°角。第二次画线是用接种环划过第一次画线部分，即是把第一次划在平板上的菌液作为菌源，画线方法与面积同第一次。然后再转动70°角，灼烧接种环后做第三次画线。画线时注意不要把培养基划破，最后一次平行画线不要与第一次画线相接，否则达不到分离的目的。 几种常用画线方式： 画线完毕后，将平板倒置于恒温箱中培养，待长出菌落后进行观察，方法同稀释法。 2.细菌的计数：除了对细菌进行观察外，有时还要调查各种样品中的细菌数量。如对水污染程度的调查、水质标准的调查及食品卫生的检查等。细菌的计数方法一般有显微计数法和菌落平板计数法。 （1）显微计数法：利用血球计数器在显微镜下直接计数，是常用的计数方法。血球计数器是一块特制的载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台。中间的平台较宽，而且被一短横槽隔成两半，两个半边上各刻有一个方格网。每个方格网分成9个大格，中央的大格是计数室。 计数室的刻度有两种：一种是由25大格组成，每个大格又分成16个小格，25×16=400小格；另一种是由16大格组成，每个大格又分成25个小格，16×25=400小格。两种的总体积均为0.1mm3。计数器的构造如图4-5和图4-6所示。 计数方法：25×16的计数器，显微镜下数左上、右上、左下、右下和中央共五个大格，即5×16=80小方格的细菌数。若80小格的细菌数为A，则每毫升菌液的含菌量=A×400/80×10×1000=50000A；16×25的计数器，显微镜下数左上、右上、左下、右下共四个大格，即4×25=100个小格的细菌数。若100小格的总菌数为A，则每毫升菌液的含菌量=A×400/100×10×1000=40000A。 （2）平板菌落计数法：因为每个活的细菌在平板上繁殖都能形成一个菌落，即平板上的菌落数等于接入平板的活菌数。如果待测的样品细菌稀少（如自来水），则可以直接接种到培养基，制成平板。但许多样品细菌的密度都很大，为使计数准确，首先应将待测样品稀释成不同稀释度的菌液。再取一定稀释度、一定量的菌液，接种到培养皿中，制成平板。经培养后，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。具体操作同稀释分离方法。 计数时，按下列公式计算： 每毫升菌液的活菌数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数×5。

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