如何从真核微生物中获取一已知氨基酸序列的蛋白质水解酶基因

2025-02-22 06:21:56

推荐回答（3个）

回答1：

蛋白质水解在消化道内进行不需要能量，但在细胞内进行需要能量。
蛋白质经泛素-蛋白酶体的选择性降解途径
——2004年诺贝尔化学奖评述
赫荣乔
（中国科学院生物物理研究所，视觉信息加工重点实验室）
2004年诺贝尔化学奖授予了以色列的阿龙·切哈诺沃（Aaron Ciechanover）、阿夫拉姆·赫什科（Avram Hershko）和美国的欧文·罗斯（Irwin Rose），以表彰他们就发现和阐明蛋白质经泛素-蛋白酶体的选择性降解途径所作的杰出贡献。大多数蛋白酶（包括溶酶体酶体系）降解底物时不需要三磷酸腺苷（ATP）提供能量，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。20世纪50年代初，Simpson在肝脏组织培养的切片中检测到了氨基酸的产生，揭示出细胞内大部分蛋白质的降解需要能量。真核生物如何识别和选择性降解蛋白质是细胞生命过程中的重要环节，对于维持蛋白质在细胞内含量的动态平衡起着关键性作用。泛素-蛋白酶体需能降解途径的发现，揭示了蛋白质在细胞内选择性降解的普遍方式。需要清除的蛋白质，通过其赖氨酸残基侧链ε-氨基连接多聚泛素链（降解标签），继而在蛋白酶体中被降解。
泛素-蛋白酶体降解途径包括两个主要阶段。第一阶段为泛素与蛋白底物的相互作用：①高能硫酯键E1-泛素复合物的形成，消耗一分子ATP，并释放一分子单磷酸腺苷（AMP）和一分子焦磷酸。②活化泛素（E1-泛素复合物）转移到E2s上，释放出E1，形成高能键E2-泛素复合物。③底物（被磷酸化、氧化、错误折叠或与辅助蛋白结合的蛋白质）被E3s识别并与之结合。④E2-泛素复合物上的泛素转移到E3s上，形成高能键复合物，继而底物通过赖氨酸的ε-氨基形成酰胺键与泛素连接，泛素分子逐个相加形成链状结构。此外，第一个泛素分子也可与底物N末端氨基酸残基连接。第二阶段为蛋白酶体对底物的降解：⑤底物泛素链与蛋白酶体19S的泛素受体相互作用，蛋白底物去折叠，并通过蛋白酶体受体端裂隙进入20S核心颗料内部，被逐步降解；⑥在泛素C-端水解酶、脱泛素酶和寡肽酶的作用下，释放出泛素分子（可再次参与循环）。
泛素-蛋白酶体系统由以下几个组分构成。①泛素：含有76个氨基酸残基，分子量约8.5kDa，广泛存在于真核细胞（原核细胞中尚未发现）。泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号。另外，泛素化在蛋白的内吞和外泌作用中有目标定位功能。②泛素活化酶E1：通过半胱氨酸残基与泛素C端活化的甘氨酸残基形成硫酯键，E1-泛素中间体中的泛素可以转移给数个E2s。③泛素转移酶E2s：以泛素结合酶方式起作用，活性部位为半胱氨酸，部分E2成员在细胞特定过程中发挥作用，但E2的全部作用尚不清楚。④泛素连接酶E3s：为泛素-蛋白酶体系统选择性降解机制的关键因素，识别被降解的蛋白并将泛素连接到底物上。目前对E3s作用方式了解相对较少。不同E3s的氨基酸序列差异较大，并且与多种不明功能的亚单位组成复合物，其功能需进一步研究。⑤蛋白酶体（2.5MDa）：由2个19S和1个20S亚单位组成的桶状结构，19S为调节亚单位，位于桶状结构的两端，识别多聚泛素化蛋白并使其去折叠。19S亚单位上还具有一种去泛素化的同功肽酶，使底物去泛素化。20S为催化亚单位，位于两个19S亚单位的中间，其活性部位处于桶状结构的内表面，可避免细胞环境的影响。酵母20S亚单位由四个环状结构（αββα）组成。
泛素-蛋白酶体系统与蛋白质质量控制、细胞周期、DNA修复、转录及免疫应激等密切相关，也与许多种疾病的发生相关。为了证实泛素-蛋白酶体系统在细胞生命过程中的重要作用，Masa-atsu Yamada等（1980）建立了泛素-蛋白酶体缺陷型细胞系，通过诱变鼠细胞并筛选出温度敏感型ts85细胞系，在敏感温度下该细胞株出现染色体异常浓缩和组蛋白磷酸化不足，细胞周期被固定在G2期（DNA复制完成，尚未进入有丝分裂期）。这表明此缺陷可能导致染色质结构的异常改变。值得注意的是，Marunouchi所在的日本研究团队观察到泛素化组蛋白H2A，该蛋白的泛素化为温度依赖型。在适宜温度下细胞内的H2A被泛素化，在敏感温度下其泛素化则被抑制。组蛋白H2A的泛素化需要ATP，在敏感温度下泛素化速度减慢。在野生型或ts85突变细胞中均未观察到这种现象。基于H2A在ts85突变细胞中的泛素化现象，Varshavsky等证实了ts85细胞中温度敏感性组分是E1。
上述ts85细胞系的研究工作奠定了泛素参与细胞周期调控的基础。同时，细胞周期调控因子Cdc34被证实是泛素转运酶E2中成员之一，在进化上高度保守。Kirschner等进一步证明了细胞退出有丝分裂的关键是细胞周期蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解所致。后来，Nasmyth等证实在有丝分裂和减数分裂过程中，E3对染色体的分离起着关键作用。有丝分裂和减数分裂过程中染色体的错误分离则可导致染色体数目改变，也是导致人类自发性流产的最主要原因。如Down氏综合征（21染色体三体细胞）；绝大多数恶性实体瘤细胞中也存在染色体数目异常。肿瘤抑制因子P53蛋白被称为"基因组卫士"，50%以上的人类癌症中均发现该蛋白的突变。P53经泛素-蛋白酶体途径降解，其中E3与P53形成复合体。DNA损伤后，P53出现磷酸化，降低与E3的结合，减少P53的降解，维持P53在细胞内的含量。人类乳头瘤病毒的感染与子宫颈癌的发生密切相关。此病毒通过利用自身编码的蛋白激活寄主细胞的E3酶，使P53蛋白泛素化降解，而避开P53的抑制作用，使感染细胞不能正常进行DNA修复，突变的积累最终导致癌变的发生。
神经退行性疾病，如老年疾呆、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化等，存在老年斑、纤维样沉积等现象，尽管在形态学上看不出泛素所起的作用，但泛素-蛋白酶体降解系统可能出现某种缺陷，使得错误折叠的蛋白质不能被降解，而在体内积累并产生细胞毒性。由于泛素样蛋白质PakinC端不含甘氨酸残基，故不能形成类似泛素的链状结构而难以降解，该蛋白被认为与帕金森病有关。转录因子NF-κB在免疫和炎症反应中起重要作用。正常情况下，NF-κB与细胞质中的抑制蛋白IκB形成非活性复合体。当细胞受到细菌感染或有自身物质信号时，IκB被磷酸化，进入泛素介导的蛋白质酶解系统被降解，NF-κB则转移至细胞核内，启动相关基因的表达。泛素-蛋白酶体系统也产生一些肽段，这些片段可被MHC-I类分子呈递给T淋巴细胞，从而在防御病毒感染中起作用。遗传性囊性纤维化（Cystic Fibrosis，CF）与一种囊性纤维跨膜电导调节因子（细胞质膜氯离子通道调节因子，CFTR）的功能性缺失有关。绝大多数CF病例由单基因位点突变所致，表现为苯丙氨酸（?F508）缺失，造成CFTR蛋白的错误折叠，被泛素介导的蛋白质酶解系统识别、降解，造成该因子功能性缺失。泛素系统已成为研制相关药物的靶点，通过防止特定蛋白的降解，或通过激发此系统以降解不需要的蛋白质，达到防治某些疾病的目的。一种蛋白酶体抑制因子Valcade（PS341），作为新药用于治疗多发性骨髓瘤已经进入临床试验阶段。
泛素-蛋白酶体降解系统的发现为深入理解细胞诸多生理过程奠定了基础。可以预见，将会发现更多的蛋白质和细胞生理过程与此途径相关，也会有一些疾病的病理机制基于此系统得以阐明，以该系统为靶点的新药也将逐渐增多。泛素-蛋白酶体系统研究领域有着巨大的发展潜力。

回答2：

1、利用真核生物的polyA，RT-PCR后电泳；
2、根据核酸序列，估算对应的核酸序列的长度范围；
3、根据电泳结果选择合适的条带，回收片段；
4、测序后，对比相应的氨基酸序列，选择目的基因。

回答3：

用该种基因对应的限制性内切霉，分割DNA可得。

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