raw264.7细胞培养

抗坏血酸抑制核因子κB受体活化子配体

诱导RAW264.7细胞的分化和功能

肖新华 周厚德 袁凌青 谢辉 廖二元

作者单位：410011长沙，中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所

【摘要】 目的 研究抗坏血酸对核因子κB受体活化子配体（RANKL）诱导体外培养的破骨前体细胞RAW264.7形成成熟多核破骨细胞的影响，探讨抗坏血酸在破骨前体细胞分化中的作用及机制。 方法 利用不同浓度的抗坏血酸与RANKL单独或共同处理RAW264.7细胞，MTT法测定细胞增殖，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法观察TRAP阳性多核细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定破骨细胞表型基因和功能基因的表达，Western印迹方法检测碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达，破骨细胞的骨吸收功能用骨吸收陷窝面积计数法分析。 结果 抗坏血酸和RANKL都抑制RAW264.7细胞的增殖 (P<0.05)，但它们之间无协同作用。抗坏血酸本身不能诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞，但可抑制RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成(P<0.05)。抗坏血酸下调RANKL诱导的碳酐酶Ⅱ和 RANK基因 mRNA表达及碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达，抑制骨吸收功能(P<0.05)。 结论 抗坏血酸能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和功能。

【关键词】 抗坏血酸； 破骨细胞； 骨吸收

抗坏血酸(AA)是一种重要的营养素和氧化还原剂,在骨盐代谢及骨形成中具有重要作用。在体外，它能增加钙盐的沉积，促进矿化结节的形成，并通过间充质细胞间接调节破骨细胞的分化〔1-4〕。流行病学调查表明，饮食中抗坏血酸的摄入与骨密度（尤其是绝经后妇女）呈正相关〔5，6〕。抗坏血酸在骨重建中的作用十分重要，但其细胞生物学机制仍不清楚。虽然在鼠的骨髓细胞与ST2基质细胞共培养下，它可通过ST2细胞表达核因子κB受体活化子配基(RANKL)诱导破骨细胞形成〔1〕，但是否可不通过成骨/基质细胞而直接作用于破骨前体细胞，进一步影响破骨细胞的分化和功能目前尚不清楚。本研究旨在探讨抗坏血酸对RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞的影响及机制。

材料与方法

一、细胞培养

小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次, 细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。

二、细胞增殖测定

接种于96孔板的RAW264.7细胞用抗坏血酸(美国Sigma-Aldrich公司)和/或RANKL(美国Pierce公司)干预48 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml，美国Sigma-Aldrich公司) 20 μl, 继续培养4 h后弃上清，加人二甲亚砜（DMSO）150 μl/孔孵育10 min, 在酶标仪上测570 nm波长下的吸光值。

三、破骨细胞形成分析

RAW 264.7 细胞以1×104/孔接种于6孔板，培养过夜后分别用50 ng/ml RANKL和不同浓度（10～100 μg/ml）的抗坏血酸干预，细胞每3 d换液1次。第6天抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色(美国Sigma-Aldrich公司,387-A)，细胞用柠檬酸盐/丙酮溶液固定30 s, 在以萘酚AS�BI磷酸盐作为底物的孵育液中37°C孵育1 h，蒸馏水洗3次，苏木素复染2 min，干燥后二甲苯透明，DPX(聚苯乙烯+酞酸丁二酯+二甲苯)封固，光镜观察。显微镜下计数TRAP阳性多核破骨细胞（≥3个核）。

四、骨吸收陷凹分析

RAW264.7接种于钙磷覆盖的破骨细胞活性分析板（OAAS）(美国OCT公司)，100 ng/ml RANKL和抗坏血酸干预细胞6 d后，弃上清,磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，5%次氯酸钠孵育5 min，PBS漂洗。干燥后采集骨吸收凹陷图像，骨吸收面积用Image Pro-Plus软件（美国Media Cybernetics公司）分析。

五、RNA提取和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

用Trizol（美国Gibco公司）按操作说明提取细胞总RNA，用无RNA酶的DNA酶 I 消化痕量DNA，二乙基焦碳酸（DEPC）处理水溶解RNA。在Gene Amp 2400 PCR扩增仪上进行RT-PCR。取0.5μg总RNA, 用逆转录试剂盒(美国Promega公司)合成cDNA, 再行PCR扩增RANK, 基质金属蛋白酶9(MMP9), 肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),TRAP,整合素αv ,整合素β3 , 组织蛋白酶K,碳酐酶Ⅱ, 扩增条件及引物序列见表1, 引物由上海博亚生物工程有限公司合成。半定量RT-PCR测定以β-肌动蛋白作为内部质控。PCR产物用1.2%琼脂糖电泳，溴乙啶染色后于紫外灯下拍照。

表1 PCR引物及退火温度

基因
正向引物 （5′→3′）
反向引物（5′→3′）
退火

温度

（℃）

TRAP
ACACAGTGATGC-

TGTGTGGCAACTC
CCAGAGGCTTCC-

ACATATATGATGG
57

蛋白酶k
CTGAAGATGCTT-

TCCCATATATGGG
GCAGGCGTTGTT-

CTATTCCGAGC
56

RANK
ACCTCCAGTCAG-

CAAGAAGT
TCACAGCCCTCA-

GAATCCAC
57

MMP-9
CGAGTGGACGCG-

ACCGTAGTTGG
CAGGCTTAGAGC-

CACGACCATACAG
64

β-肌动蛋白
GAAGAGCTATGA-

GCTGCCTG
CACAGAGTACTT-

GCGCTCAG
57

碳酐酶Ⅱ
CTTCAGGACAAT-

GCAGTGC
ATCCAGGTCACA-

CATTCCAGC
55

TRAF6
AGCCCACGAAAG-

CCAGAAGAA
CCCTTATGGATT-

TGATGATGC
53

整合素αv
GCCAGCCCATTG-

AGTTTGATT
GCTACCAGGACC-

ACCGAGAAG
55

整合素β3
TTACCCCGTGGA-

CATCTACTA
AGTCTTCCATCC-

AGGGCAATA
53

六、Western 印迹

用细胞裂解液（150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris, pH 7.5, 1% NP-40, 0.25%去氧胆酸钠, 1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF), 1 mmol/L NaVO4, 2 mmol/L EGTA, 50 μg/ml 亮抑酶肽）冰上孵育裂解细胞20 min, 将匀浆于10 000 r/min，4℃离心5 min。BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司) 定量后，各取50 μg蛋白于10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜至PVDF膜（美国Millipore公司），含5%脱脂奶的PBST(含0.01% 吐温-20的PBS) 封闭液室温下振荡2 h，抗碳酐酶Ⅱ的抗体(1∶〖KG-*2〗1000)(美国Santa Cruz公司)孵育3 h, 含辣根过氧化酶标记二抗 (1∶5000) (美国Santa Cruz公司)孵育1 h, PBST室温下漂洗15 min后，化学发光法显影(美国Santa Cruz公司)。

七、统计分析

以上数据以 ±s表示,各组间比较采用One-way ANOVA过程的LSD法。

结果

一、抗坏血酸抑制细胞增殖

抗坏血酸在10～100 μg/ml浓度范围内有促进RAW264.7细胞增殖的趋势，但差异无显著意义。高浓度的抗坏血酸（500 μg/ml）明显抑制细胞增殖(0.13±0.05 vs 1.11±0.22，P<0.05，图1A)。RANKL明显抑制细胞增殖(1.58±0.22 vs 1.26±0.17)，但抗坏血酸10~100 μg/ml浓度与RANKL无协同作用(图 1B)。

注:除对照外,每组为AA(μg/ml)加RANKL 50 ng/ml

图1 抗坏血酸对RAW264.7细胞的增殖作用A.AA对RAW264.7细胞增殖的影响(与对照组相比, **P<0.01)；B. AA联合/或RANKL对RAW264.7细胞增殖的影响(与对照组相比, *P<0.05)

二、抗坏血酸抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞形成破骨细胞

单独应用抗坏血酸不能使RAW264.7细胞形成TRAP阳性多核破骨细胞，但10～100 μg/ml浓度抗坏血酸均能抑制RANKL诱导RAW264.7细胞形成破骨样多核细胞（P<0.05，图2）。

注:每组为AA(μg/ml)加RANKL 50 ng/ml浓度

图2 抗坏血酸(AA)对RANKL诱导RAW264.7细胞形成TRAP阳性多核细胞影响,与AA0组比较, *P<0.05

三、抗坏血酸选择性下调破骨细胞特征性基因mRNA的表达

RAW264.7细胞受RANKL刺激后碳酐酶Ⅱ ,组织蛋白酶K, TRAP mRNA的表达均明显增加(分别为10、1.5 和 1.5倍)。抗坏血酸单独能上调组织蛋白酶 K, TRAP mRNA的表达(分别为1.4和1.9倍)。然而，RANKL与抗坏血酸合用与单用RANKL相比，前者明显抑制碳酐酶II和 RANK mRNA表达(分别为60%和20%)。MMP9, 整合素 αv 、整合素 β3 ,TRAF6基因不受RANKL和抗坏血酸的影响(图3)。

四、抗坏血酸抑制破骨细胞骨吸收

抗坏血酸不能诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞，故无骨吸收陷窝。抗坏血酸和RANKL合用与单用RANKL组相比，骨吸收陷窝的数目及面积明显减少（P<0.05，图4）。

五、碳酐酶Ⅱ蛋白表达

碳酐酶Ⅱ蛋白的表达光密度比，对照组、AA（50 μg/ml）组、RANKL（50 ng/ml）组、RANKL (50 ng/ml)+AA(10 μg/ml)组、RANKL（50 ng/ml）+AA(50 μg/ml)组分别为0.92±0.26、1.10±0.30、1.21±0.34、0.76±0.19,1.06±0.28。

RANKL组与对照组相比，碳酐酶Ⅱ蛋白表达无明显增加。低浓度的抗坏血酸（10 μg/ml）与RANKL合用与单用RANKL相比，碳酐酶Ⅱ蛋白表达明显减

1.RANKL 50 ng/ml；2.RANKL 50 ng/ml+AA 50 μg/ml；3.AA 50 μg/ml；

4.对照组

图3 破骨细胞表型基因和功能基因的表达

注：每组为AA（μg/ml）加RANKL 100 ng/ml,与AOO组比较，*P<0.05

图4 抗坏血酸对破骨细胞骨吸收活性的影响

少（P<0.05）。

讨 论

尽管抗坏血酸的发现与应用已有200多年，但其在人类健康和疾病中的意义与作用机制尚未完全阐明，研究结论不一致。了解抗坏血酸调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能的分子机制有重要意义。抗坏血酸是胶原合成的原料, 参与脯氨酸羟化以合成胶原，缺乏时可导致脯氨酸和赖氨酸羟化作用减弱从而影响胶原的合成，同时还是成骨细胞标志物表达和矿化所必需〔7-9〕。抗坏血酸在胶原合成中起关键作用，又是胶原翻译后修饰酶所需的羟化酶和单氧酶的协同因子〔10，11〕。最近，我们的研究发现，抗坏血酸协同并上调雌激素增加成骨细胞OPG基因表达与碱性磷酸酶（ALP）活性〔12〕。而抗坏血酸对破骨细胞的分化及功能的研究了解较少。

有研究认为，抗坏血酸在破骨细胞发生的过程中发挥生理作用，可能依赖于其氧化还原特性，促进羟化反应以维持金属离子活化中心保证羟化酶和单氧酶的活性〔1〕。基质细胞与骨髓细胞共培养时，抗坏血酸与1α,25(OH)2D3 联用与单用1α,25(OH)2D3相比，前者的破骨细胞分化明显增加，基质细胞的RANKL mRNA表达量较后者增加了4.7倍〔1〕。Ragab等的研究结果表明，抗坏血酸可使破骨前体细胞TRAP表达及融合成成熟的多核破骨细胞增加，其作用是通过调节间充质细胞的分化状态而间接支持破骨细胞分化〔4〕。目前，许多体外破骨细胞形成体系采用基质/成骨细胞与破骨前体细胞共培养，因此并不清楚抗坏血酸能否不通过基质/成骨细胞而直接作用于破骨前体细胞影响破骨细胞的形成。我们采用的RANKL诱导破骨前体细胞RWA264.7细胞形成破骨细胞可避免了基质/成骨细胞对破骨细胞的干扰。

抗坏血酸本身不能诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞，但与RANKL合用明显抑制破骨细胞形成和功能，其详细机制尚不清楚。由于抗坏血酸可促进成骨细胞合成胶原从而促进骨形成，在有基质/成骨细胞的条件下促进破骨前体细胞分化有利于骨吸收，而我们发现抗坏血酸不但可抑制破骨前体细胞的增殖，还可抑制破骨前体细胞的分化和功能而抑制骨吸收，因此抗坏血酸在成骨与破骨的生理调节中作用应是这3种作用的综合，在人体和动物模型上最终表现为有利于成骨作用。抗坏血酸在体外无基质/成骨细胞条件下抑制破骨前体细胞分化成成熟破骨细胞, 这一发现可能为抗坏血酸在骨代谢中的生理作用提供又一机制。

参考文献

1 Otsuka E, Kato Y, Hirose S, et al. Role of ascorbic acid in the osteoclast formation: induction of osteoclast differentiation factor with formation of the extracellular collagen matrix. Endocrinology, 2000，141: 3006-3011.

2 Udagawa N, Takahashi N, Akatsu T, et al. Oringin of osteoclasts:mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow�derived stromal cells. Proc Natl Acad Sci,1990,87，7260-7264.

3 Suda T,Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation,Endocr Rev，1992，13，66-80.

4 Ragab AA,Lavish SA,Banks MA, et al. Osteoclast differentiation requires ascorbic acid. J Bone Miner Res,1998,13，970-977.

5 Ilich JZ, Brownbill RA, Tamborini L. Bone and nutrition in elderly women: protein, energy, and calcium as main determinants of bone mineral density. Eur J Clin Nutr， 2003，57:554-565.

6 Morton DJ, Barrett�Connor EL, Schneider DL. Vitamin C supplement use and bone mineral density in postmenopausal women. J Bone Miner Res，2001，16:135-140.

7 Xiao G, Cui Y, Ducy P, et al. Ascorbic acid�dependent activation of the osteocalcin promoter in MC3T3�E1 preosteoblasts: requirement for collagen matrix synthesis and the presence of an intact OSE2 sequence. Mol Endocrino,1997，111:1103-1113.

8 Takeuchi Y, Nakayama K, Matsumoto T. Differentiation and cell surface expression of transforming growth factor-b receptors are regulated by inter�action with matrix collagen in murine osteoblastic cells. J Biol Chem, 1996,271: 3938-3944.

9 Takeuchi Y, Suzawa M, Kikuchi T,et al. Differentiation and transforming growth factor-b receptor down-regulation by collagen�a2b1 integrin interaction is mediated by focal adhesion kinase and its downstream signals in murine osteoblastic cells. J Biol Chem，1997,272:29309-29316.

10 Navas P, Villalba JM, Cordoba F. Ascorbate function at the plasma membrane. Biochem Biophys Acta，1994， 1197:1-13.

11 Franceschi RT.The role of ascorbic acid in mesenchymal differentiation. Nutr Rev，1992，50:65-70.

12 Zhou HD, Liao EY, Deng XG, et al. The synergistic action of estradiol and L-ascorbic acid on the osteoblast-like cell line MG63. Chin J Geriatr, 2001, 20: 374-378.

周后德, 廖二元, 邓小戈, 等. 雌二醇与抗坏血酸对成骨细胞的协同作用. 中华老年医学杂志, 2001, 20：374-378.

希望这些对你有帮助！