酵母单杂交方法分析转录激活活性的原理和过程

酵母单杂交方法分析转录激活活性的原理和过程是什么啊~谢谢

2025-02-18 11:47:18

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回答1：

0 引言
酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析. 运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.
1 酵母单杂交技术的原理
酵母单杂交技术最早是1993年由Li et al [1,2]从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究[3-6]，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控.
目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与.这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD).用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子.研究[2]表明GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录.正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒.在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.

2 酵母单杂交技术的应用
酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功能上是由独立的DNA结合结构域和DNA激活结构域组成的基础上，这使得研究者可以构建不同的基因融合体，在酵母中表达融合蛋白，以同时结合特异的目的基因和激活转录. 理论上，在酵母单杂交技术中，任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋白[2].
目前,酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类:
2.1鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面. Chew et al [7]应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质是GRIK5基因的内含子结合蛋白，从而进一步验证了多种核孤儿受体可通过与内含子序列结合发挥其调控神经递质受体基因作用的假设. Wei et al [8] 1999年运用此技术确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE)基因调控区域的反式激活因子SpEst4. Sieweke et al [9]运用酵母单杂交技术对转录辅助因子进行了筛选. Huang et al [10]为分离与人ε-珠蛋白基因上游沉默子片段相互作用的蛋白，运用酵母单杂交技术，利用人肝cDNA文库进行筛选，得到能与其结合的蛋白RPL3(ribosomal protein L3),并通过电泳迁移率变动实验(EMSA)和竞争抑制实验证实其确有结合该沉默子活性,进而说明RPL3通过与人ε-珠蛋白基因上游沉默子结合，在胚胎阶段的沉默人ε-珠蛋白基因表达中扮演了重要角色.Liao et al [11]于2002年运用酵母单杂交技术筛选出了能与大鼠谷胱甘肽S-转移酶(GST) P增强子GPEⅠ核心序列相互作用的转录因子，经对2个阳性克隆pYGPE1和pYGPE2的鉴定发现pYGPE1的插入片段与大鼠原癌基因c-juncDNA具有99 %同源性，其编码的氨基酸残基序列与大鼠c-jun蛋白具有100 %同源性，pYGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶cDNA具有99 %同源性,其编码的氨基酸序列与大鼠腺苷酸转位酶具有100 %同源性，并由此得出结论c-jun蛋白和线粒体腺苷酸转位酶可能是作用于GPEⅠ的反式激活因子.
2.2对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析[2]. 早在1993年，就有人[12,13]用酵母单杂交技术对2个不同的锌指蛋白的DNA结合结构域进行了分析.Lisowsky et al [14]在1999年使用酵母单杂交技术，利用一个“GC”富集区序列筛选出一种新的具有转录激活活性的锌指蛋白，由于其结合的序列富含“GC”，故命名为GC-box 结合蛋白. Mak et al [15]运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性，并进一步证明运用酵母单杂交技术能在哺乳动物cDNA文库中筛选出与E-box DNA相互作用的新的bHLH蛋白. Nishiyama et al[16]运用酵母单杂交技术并结合点突变方法对转录活性片段Elf-1进行分析，确定具有转录活性的区域位于第87-175碱基区.
3 存在问题及解决办法
3.1在鉴别DNA结合位点中存在的缺陷由于细胞技术的先天局限性,即影响因子多，因此，可能有内源性的酵母表达激活物与DNA结合位点结合,并激活报告基因的表达，则相应的目的基因片段可能因此而被漏检. 这个问题在试图鉴定某基因组中所有的DNA结合位点时就会暴露出来.此缺陷的补救需要一个更加随机的文库.例如，可以用含有更多的已突变的片段构建一个随机剪切的DNA片段库.另一个比较关心的问题就是此技术的检测灵敏度，有报道[2]显示此系统对于HIS3基因表达是非常灵敏的，即使是很弱的、甚或非特异性的相互作用都能被检测到，这些非特异的相互作用可通过其他技术[2]避免，但这也可能导致此方法灵敏度的过度下降.
3.2在DNA结合结构域分析中存在的缺陷用酵母单杂交技术分析突变导致DNA结合结构域改变的局限在于此方法的灵敏度依靠DNA结合结构域功能选择,只有当突变影响了DNA结合结构域的功能时,才能被发现. 改进的方法是在培养基中选择合适的半乳糖浓度[2]，以减少杂交激活子的激活活性，或用不同的阴性对照等方法.
总之,随着生物化学及分子生物学技术的不断发展，越来越多的大分子间相互作用被人们所认识，这将有助于人们阐明生物体内各种生物学过程的发生情况，并可能由此发现新的基因工程药物.酵母单杂交技术作为一种研究生物大分子间的相互作用的体外、细胞内技术，从1993年发展至今，已有近10 a时间，虽然有关的报道不是很多，但在生物学研究领域，特别是在研究DNA-蛋白质相互作用方面他还是显示出了巨大的应用潜力，而且，由酵母单杂交技术衍生出的反向单杂交技术及单-双杂交技术更是拓宽了其应用范围[17].运用酵母单杂交技术不但可以验证许多已知的DNA-蛋白质间相互作用，而且可以发现新的DNA-蛋白质间相互作用，并由此发现新的基因.相信随着酵母单杂交技术的不断发展和完善，必将在科研、临床及生产中得到更加广泛的应用.
【参考资料】http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/450.asp

回答2：

http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/450.asp

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