DNA连接酶只能修补DNA双链中有一个小缺口的单链，也就是说，这个缺口的对面，DNA是完整的，不是断裂的。如果两条链在同一个地方断裂就是2条DNA了，这时连接酶没作用，当然，如果DNA上有不止一个小缺口，只要DNA双链还完整，DNA连接酶就可以进行修补。DNA聚合酶在DNA复制中期延长作用，根据另一条链按碱基互补不断延长DNA，而DNA复制中所出现的引物水解后留下的缺口，就由DNA连接酶来修补。RNA聚合酶和DNA聚合酶差不多，就是连接核糖核苷酸形成磷酸二酯键.在DNA复制中(合成引物)和转录中起作用。
DNA连接酶：基因工程里，把切开的两段DNA连起来DNA聚合酶：DNA复制时，把单个的
脱氧核苷酸
连到正在合成的DNA链上RNA聚合酶：转录或RNA自我复制时，把核糖核苷酸连接到正在合成的RNA
链上。区别是：连接两段：(DNA1)＝＝＝＝＝
＝＝＝＝＝＝(DNA2)
↑DNA连接酶把单个连到一段上：(脱氧核苷酸)-
--------(DNA新单链)
↑DNA聚合酶把单个连到一段上：(核糖核苷酸)-
--------(RNA新单链)
↑RNA聚合酶共同点是：都连接形成
3,5-磷酸二酯键
是这个样子的。dna聚合酶不但有成键活性，还有外切活性，你说的dna聚合酶能将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键，是正确的，但是，dna聚合酶的工作，只能由一段引物起始，这是必须的。
通常，dna聚合酶是个庞大的复合体。他的复制dna的方向是3'末端到5'末端。而2条dna链是方向的，dna聚合酶开始复制，需要引物，一条链的合成是连续的，从3'末端到5'末端，但另一条链方向却和dna聚合酶合成方向相反。因此，另一条链是分段复制的。每一段，称为一个冈崎片段。简单的说，冈崎片与冈崎片之间的磷酸二酯键是不能由dna聚合酶产生，这个磷酸二酯键是dna连接酶完成。
dna连接酶不但参与2个冈崎片间的磷酸二酯键形成，也参与dna损伤修复中的磷酸二酯键形成。
dna连接酶和dna聚合酶都能在两dna片段之间形成磷酸二酯键，只是过程不一样，效果也不一样。
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