DNA的粗提取与鉴定 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同较低(高)浓度可使DNA溶解;0.14mol/L可使DNA析出。在溶解细胞中的DNA时,人们通常选用2mol/LNaCl溶液;将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水,以稀释NaCl溶液。(用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质,需要进一步提纯DNA。)
DNA不溶于酒精。酒精是一种常用有机溶剂,但DNA却不能溶于酒精(特别是95%冷却酒精),但细胞中蛋白质可溶于酒精。 滤液与等体积的冷却酒精混合均匀,静置2~3分钟,析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。
提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。蛋白酶,因为酶具有专一性,蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。
温度值为60~80℃,因为该温度值蛋白质变性沉淀,而DNA不会变性。 补充:DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋,其温度在80℃以上,如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。
洗涤剂将细胞膜上的蛋白质,从而瓦解细胞膜。当鉴定提取出的物质是否是DNA时 在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺呈现蓝色。研磨不充分会使DNA的提取量减少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 具体做法。试管2支,编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物,使之溶解→各加4mL二苯胺,混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化 原理总结:通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以从细胞中提取和提纯DNA;再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来,达到提纯的目的;最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。 实验材料的选取 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时,应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富,材料易得;二是鸡血细胞极易吸水胀破,而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心,对设备要求较高,操作繁琐,历时较长。 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取过程中为了减少DNA的损失,最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 具体做法。10mL鸡血+20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液 去除滤液中的杂质 注意事项:在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度;使用塑料烧杯;使用尼龙布过滤;玻棒沿同一方向搅拌;玻棒搅拌要缓慢(细胞破裂快速搅拌);玻棒不要碰到烧杯壁;二苯胺试剂要现用现配等。