85问答库 > 请问做反转录有哪些注意事项吗？我做完反转录后跑PCR什么条带都没有，可觉得RNA质量没问题，帮帮忙了

请问做反转录有哪些注意事项吗？我做完反转录后跑PCR什么条带都没有，可觉得RNA质量没问题，帮帮忙了

2024-12-02 15:15:43

推荐回答（3个）

回答1：

RNA质量没问题，按照试剂盒说明书进行反转录操作就行了
可以用actin为内参扩一下，如果扩出来了，就是你自己设计的引物问题，得重新设计引物，如果扩不出来，就是你反转录CDNA的质量问题了，用其他的反转录试剂盒试试

回答2：

避免RNase的污染，冲提取RNA开始就应该注意这个问题；

反转录结束后一般选择一个高表达的基因做PCR，如actin，检测反转录有没有成功。

反转录酶也要注意保护好，避免失活，在加入RTase的时候，要注意等到前一步骤的温度降下来后才能加入。

回答3：

避免RNase的污染，建议用TRNsol（Trizol）来提取。提RNA最大的要诀就是快。毕竟要创造一个绝代无RNase的环境是不可能，快，就能减少RNase的影响时间。
做反转录是用试剂盒还是自己配试剂？自己配制是否使用了RNase抑制剂？是否有做阳性对照？如果对照有信号，而目标产物无，很大可能是引物有问题。否则，可以使用下一步法（one step RT-PCR),这样能减少操作步骤。