国家标准检测蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法就是检测N元素的含量，像三聚氰胺的问题，就是通过增加N的含量使“蛋白质”含量提高的。

国家标准检测蛋白质含量的方法叫做凯氏定氮法，食物中的蛋白质在催化加热条件下分解，导致氨和硫酸结合产生硫酸铵。 碱蒸馏采用无硫，硼酸吸收，用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸耗计算氮含量，再乘以转化系数，即蛋白质含量。

具体操作步骤如下：

1.样品处理

精确称量0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸收10-20ml液体样品（约30-40mg氮当量）。将其转移至干燥的100毫升或500毫升氮气固定瓶中，加入0.2克硫酸铜，6克硫酸钾和20毫升硫酸，轻轻摇动，在瓶口放置一个小漏斗，将瓶子倾斜石棉网上有45度角，有小孔。

加热小火后，内容物碳化，泡沫完全停止，加强火力，保持瓶内液体稍微沸腾，直至液体呈蓝绿色澄清透明，然后继续加热0.5小时。取出并冷却，小心加入20毫升水，冷却，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗净氮气瓶，洗净液放入容量瓶中，然后用水冲洗至刻度，混匀备用。

取相同量的硫酸铜，硫酸钾和浓硫酸作为试剂进行空白试验。然而，这种方法很危险，很难在实验室中证明。大多数实验室都有一个消化器，可以一次处理16个以上的样品和一个可以自行设定温度的呼吸机。它更安全，更可操作。

2.装好定氮装置

根据附图安装氮固定装置。 在约2/3的水蒸气发生器中加入几滴甲基红指示剂和几毫升硫酸以保持水呈酸性。 添加几个玻璃珠以防止突然沸腾。 蒸汽发生瓶中的水由压力调节器加热。

3.向接收瓶内加入试剂

将10ml 2％硼酸溶液和一滴混合指示剂加入到接收瓶中，并将冷凝管的下端插入液面下。将10.0ml样品消化液从小玻璃吸收到反应室中，用10ml水洗涤小烧杯以流入反应室，并拧紧小玻璃棒玻璃塞。

将10ml 40％氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，抬起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样容易使玻璃塞粘在样品入口处，应先用蒸馏水清洗然后盖上，并在小玻璃杯中加水以防止泄漏。

夹紧螺旋夹并开始蒸馏。蒸汽进入反应室，氨通过冷凝管进入接收瓶。蒸馏持续5分钟。移动接收瓶，使冷凝管的下端离开液体容器，然后蒸馏1分钟，然后用少量水冲洗冷凝管下端的外端。取下接收瓶，将其置于0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液中，以灰色或蓝紫色为目的地。

扩展资料

除了凯氏定氮法以外，标准的测量方法还有：

• 分光光度法

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量,结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

• 燃烧法

样品在900~1200℃下燃烧。在燃烧过程中，产生混合气体。 诸如碳，硫和盐的干扰气体被吸收管吸收，氮氧化物被还原成氮。 形成的氮气流由热导检测器（TCD）检测。

参考资料：食品中蛋白质的测定百度百科

1、凯氏定氮法

通过该方法测定出的蛋白质被称为“粗蛋白”，氮的来源有可能是真蛋白质、乳制品中正常含有的非蛋白质类化合物，也极有可能来自人为故意添加的有害含氮物质。

2、高效液相色谱法

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

高效液相色谱测定步骤

（1）HPLC 参考条件

（2）标准曲线的绘制

（3）定量测定

（4）结果计算

3、液相色谱-质谱/质谱法

试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。

液相色谱-质谱/质谱测定步骤：

（1）LC 参考条件

（2）MS/MS 参考条件

（3）标准曲线的绘制

（4） 定量测定

（5）定性判定

（6）结果计算

4、气相色谱-质谱联用法

试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。

气相色谱-质谱测定步骤

（1）仪器参考条件

（2） 标准曲线的绘制

（3）定量测定

（4）定性判定

（5）结果计算

参考资料百度百科-三聚氰胺检测国标

人民网-食品中三聚氰胺检测标准即将出台

蛋白质含量测定主要有五种方法,分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。

1.凯氏定氮法：

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。

2.双缩脲定氮法：

在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

3.紫外吸收定氮法：

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。

不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。

未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

4.酚试剂法：

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin —酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:

①在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

②Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比。

5.考马斯亮蓝法：

考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。

扩展资料

检查过程

(1) 标准法制定标准曲线　取14支试管，分两组按下表a平行操作。　绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。　

(2) 微量法制定标准曲线　取12支试管，分两组按下表b平行操作。　绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。　

(3) 未知样品蛋白质浓度测定　测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/ml)。

参考资料百度百科——蛋白质含量测定

使用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。
凯氏定氮法 凯氏定氮法

蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍

【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白质的测定方法

本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器
定氮蒸馏装置：如图所示。
（图略）
4 操作方法
4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。
4.4 计算

式中：X——样品中蛋白质的含量，%；
V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m——样品的质量(体积)，g(ml)；
F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
附加说明：
本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。
本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

国家标准检测蛋白质含量测定方法是滴定法。